小麦是全球重要的粮食作物，为人类提供主要的卡路里和蛋白质来源。然而，多种病害严重威胁着小麦的稳产高产。由小麦秆锈菌（Puccinia triticina Eriksson, Pt）引起的小麦叶锈病是全球小麦生产中最具破坏性的真菌病害之一。该病害分布广泛，在适宜条件下可导致感病品种大幅减产。随着全球气候变暖和病原菌毒性变异的加剧，叶锈病的发生范围显著扩大，对全球小麦安全构成了严峻挑战。培育和种植抗病品种被认为是控制小麦叶锈病最经济、有效和环境友好的策略。迄今为止，已在小麦及其近缘种中鉴定并命名了超过80个叶锈病抗性（Lr）基因。然而，由于小麦基因组庞大且复杂，目前仅有少数Lr基因被成功克隆。克隆新的Lr基因对于深入理解小麦抗病机制、开发分子标记辅助育种、创制持久抗性品种（例如通过基因聚合或构建多基因表达盒）具有重要意义。
北京大学现代农业研究院/潍坊现代农业山东省实验室的Shisheng Chen、Baoxing Song以及河北农业大学的Xiaodong Wang团队在预印本平台Research Square上发表了题为“Genome-assisted identification of wheat leaf rust resistance gene Lr30 (synonym Lr.ace-4A)”的研究论文，该研究通过结合高质量基因组组装、诱变育种和转录组测序技术，成功克隆了四倍体硬粒小麦（Triticum turgidum ssp. durum）地方品种PI 192051中的叶锈病抗性基因Lr.ace-4A。研究证明，Lr.ace-4A与先前在六倍体普通小麦中鉴定的Lr30基因为同一个基因。该基因编码一个非典型的、包含串联NB-ARC结构域的NLR（核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列）免疫受体蛋白。功能验证实验表明，Lr30是介导小麦对叶锈病产生抗性的必要且充分条件。有趣的是，Lr30在四倍体小麦中表现出近乎免疫的强抗性，但在六倍体小麦背景下的抗性水平则有所减弱。研究还发现，两个关键的氨基酸多态性位点区分了Lr30的抗病与感病单倍型，这两个位点的变异对基因功能至关重要。该研究不仅阐明了Lr30的分子特性和作用机制，还为其在小麦育种中的应用奠定了基础。
主要研究结果介绍
硬粒小麦地方品种PI 192051表现出对多个叶锈菌小种的广谱抗性
研究首先评估了葡萄牙硬粒小麦地方品种PI 192051对收集自中国的8个不同生理小种（Pt pathotypes）的抗性反应。结果显示，PI 192051的幼苗对所有测试小种均表现出高水平抗性（抗病级别'R'），而对照品种Rusty则表现为高度感病（感病级别'S'）（图1a）。当用PHQS小种接种时，感病品种Rusty在接种后6天（dpi）即出现明显的铁锈色孢子堆，而PI 192051则表现出典型的过敏性反应（Hypersensitive Response, HR），病斑处出现坏死（图1b）。通过WGA-FITC染色观察真菌在叶片内的生长情况发现，尽管病原菌能够在PI 192051叶片内形成吸器，但其后续的菌丝扩展受到显著抑制；相比之下，在Rusty叶片中，菌丝则广泛蔓延（图1c）。定量分析表明，在接种后的不同时间点（2, 4, 6, 8 dpi），PI 192051叶片中的平均真菌侵染面积显著小于Rusty（P < 0.001）（图1d）。这些结果证明PI 192051是一个优良的叶锈病抗性资源。
图1利用遗传图谱将Lr.ace-4A定位到4A染色体重组抑制区域
先前的研究已将Lr.ace-4A定位到PI 192051的4A染色体着丝粒区域一个约4.0 cM的区间内。本研究利用PI 192051与感病品种Rusty构建的F2群体（286个单株）进行遗传分析。结果显示抗感分离比约为1:3，符合单个隐性基因遗传的预期（补充图1a）。然而，利用PI 192051与由其诱变产生的感病突变体m1构建的F2群体（315个单株）进行分析，抗感分离比约为3:1，符合单个显性基因遗传的预期（补充图1b）。这种显隐性关系的逆转现象在小麦抗病基因中偶有报道。通过开发新的分子标记，研究者将Lr.ace-4A的定位区间进一步缩小。在两个群体中，标记pku1280到pku0332（在Svevo参考基因组v1.0上跨度约162.15 Mb至519.32 Mb）均与Lr.ace-4A完全连锁（补充图2b-d）。这表明该基因位于一个较大的重组抑制区域，这通常与着丝粒区域有关。细胞学分析排除了外源基因渗入或染色体倒位的可能性（补充图3），确认了该基因位于着丝粒区域。
高质量基因组组装助力Lr.ace-4A的鉴定
为了克隆Lr.ace-4A，研究团队对PI 192051进行了高质量的基因组测序和组装。利用PacBio HiFi测序和Hi-C技术，构建了一个大小为10.51 Gb的染色体级别基因组图谱，其Scaffold N50达到749.44 Mb，Contig N50达到42.53 Mb，显著优于已发表的硬粒小麦Svevo和野生二粒小麦Zavitan的基因组（图2a, 2b；补充表5, 6）。组装质量评估（LAI、QA、BUSCO）均显示其高度连续和完整。基因组共注释了65,860个蛋白质编码基因。比较基因组学分析显示PI 192051与其它四倍体和六倍体小麦基因组间存在良好的共线性关系（图2c）。对四倍体小麦群体的重测序数据分析发现，在Lr.ace-4A所在的4A染色体重组抑制区域（约150 Mb至530 Mb），遗传变异显著减少（补充图4），这符合着丝粒区域低重组的特性。
图2随后，研究者对PI 192051种子进行EMS诱变处理，筛选到7个独立的、对PHQS小种表现感病的M2/M3突变体家系（图3a）。对这7个感病突变体进行RNA-seq测序，并将读段比对到PI 192051参考基因组上。在Lr.ace-4A候选区域内，发现所有7个突变体都在同一个NLR基因（PI192051.r1.4AG0210600）上发生了EMS诱导的典型的G/C到A/T的点突变（图3b, 3c；补充图5）。该基因位于Svevo基因组的513.5 Mb处，与遗传定位结果一致。该基因包含3个外显子和2个内含子，编码一个包含1174个氨基酸的非典型NLR蛋白，其结构域特征为N端Coiled-Coil (CC)结构域、两个串联的NB-ARC结构域和一个C端LRR结构域（CC-NB-NB-LRR）（图3d）。RACE实验确定了其5'和3'非翻译区（UTR）的长度（补充图6）。这些结果共同指向PI192051.r1.4AG0210600即为Lr.ace-4A基因。
图3基因编辑和转基因互补验证Lr.ace-4A的功能
为了最终确认Lr.ace-4A的功能，研究者采用了基因编辑和转基因互补两种策略。首先，利用优化的CRISPR/Cas9系统（融合Cas9-Trex2和GRF4-GIF1蛋白）对PI 192051中的Lr.ace-4A基因进行敲除。设计了特异性靶向该基因第二外显子的gRNA（图4a），并通过生物信息学分析确认无潜在脱靶位点。成功获得了32个基因编辑阳性的T0代植株（编辑效率82.1%）（补充图7）。选取了两个纯合编辑的T0代植株（T0KO-1和T0KO-2，分别为1bp插入和1bp缺失）进行后续分析（图4a）。这两个敲除株系的T1代后代均对PHQS小种表现为感病，而野生型PI 192051则保持抗病（图4b）。这证明Lr.ace-4A是PI 192051抗叶锈病所必需的。
接着，研究者将包含Lr.ace-4A完整编码区、内含子以及上下游调控序列的9.3 kb基因组片段，通过农杆菌介导转化到感病的EMS突变体m1中。获得了25个独立的T0代转基因植株，PCR和qRT-PCR分析确认了转基因的整合和表达（补充图8a）。所有携带该转基因片段的T0和T1代植株均恢复了对PHQS小种的强抗性，而未转化的m1对照则表现感病（图4d；补充图8b）。这证明Lr.ace-4A基因足以赋予小麦叶锈病抗性。结合遗传定位、诱变筛选和功能验证结果，明确PI192051.r1.4AG0210600就是Lr.ace-4A。
图4Lr.ace-4A与Lr30为同一基因，但在六倍体小麦中抗性减弱**
Lr30是目前唯一一个定位于普通小麦4AL染色体臂上的Lr基因。其在GrainGenes数据库中的定位区间与本研究中Lr.ace-4A的位置高度重合。对Lr30单基因系RL6049中相应区段进行测序，发现其序列与PI 192051中的Lr.ace-4A完全一致。然而，文献报道和本研究均观察到，Lr30（如RL6049）仅表现出中等程度的抗性（Infection Types, ITs = 1-2）（补充图9），显著低于Lr.ace-4A在四倍体PI 192051中的近免疫水平（IT = 0;）。研究者推测Lr.ace-4A/Lr30在六倍体小麦背景下的抗性效率可能降低。
为验证此假设，将来源于PI 192051的9.3 kb Lr.ace-4A基因组片段转化到感病的六倍体小麦品种Fielder中（图5a）。大部分T0代转基因植株（如T0C652-3, T0C652-10）及其T1代（图5b；补充图11）均表现出与RL6049类似的中等抗性水平，而Fielder对照则完全感病。此外，将PI 192051的Lr.ace-4A基因通过回交导入中国普通小麦品种扬麦21（YM21）中，获得的BC2F3纯合株系同样表现出中等抗性（补充图12）。这些结果证实了Lr.ace-4A与Lr30是同一个基因，并且其在六倍体背景下的抗性效应确实有所减弱。
图5有趣的是，在Fielder转基因群体中，部分转基因事件（如T1C652-12, T1C652-27）由于转录本表达水平较高（补充图10），表现出更强的抗性，接近PI 192051的水平（图5b, 补充图11）。这暗示抗性水平可能与基因拷贝数或表达量有关。为了进一步验证，研究者构建了由玉米泛素（UBI）启动子驱动的Lr30过表达载体（图5c），并转化到Fielder中。过表达转基因株系的T0和T1代（图5d；补充图14）均表现出强抗性，且转录本水平显著高于对照（补充图13）。选取高表达的转基因株系（T1C652-12, T1C652-27）测试其对5个对Fielder强毒的小种的抗性，结果显示它们对所有测试小种均表现出强抗性（图6a），表明转基因Lr30能够复制天然基因的抗谱。
图6单倍型分析揭示关键功能位点并开发诊断标记
为了解Lr30的等位变异情况，研究者对来自多个已发表的小麦基因组以及59份接种PHQS小种后表现感病的二粒小麦（T. dicoccon）材料中的Lr30同源基因编码区进行了测序和比对分析。结果发现，在这些材料中均未找到抗病的Lr30单倍型（Hap1）。共鉴定出7种感病单倍型（Hap2-Hap8）（补充图15；补充表7）。抗病单倍型Hap1（Lr30）与其它7种感病单倍型相比，存在2-7个氨基酸差异。其中，有两个cDNA多态性位点（G1597A 和 C1984T），对应着第533位谷氨酸变为赖氨酸（E533K）和第662位精氨酸变为半胱氨酸（R662C），能够将抗病的Lr30与所有已知的感病单倍型区分开（补充图15）。研究者在一个包含约1000份小麦种质资源的外显子测序数据库中发现，仅有一个品系PI 619381同时携带1597G和1984C这两个等位基因，并且该品系在接种PHQS小种后表现出与RL6049类似的抗性反应（补充图16）。这表明E533K和R662C这两个氨基酸替换很可能是Lr30发挥抗病功能的关键。
为了验证这两个位点的功能重要性，研究者通过定点突变技术，分别构建了仅包含E533K（Lr30533K）或R662C（Lr30662C）单个突变的9.3 kb基因组片段表达载体，并转化到Fielder中。结果显示，无论是携带Lr30533K还是Lr30662C的T0和T1代转基因植株，均对PHQS小种表现为完全感病（图6b, 6c；补充图17），而表达原始Lr30片段的转基因植株则表现抗性（图5a, 5b）。这有力地证明了E533K和R662C这两个自然变异对于Lr30的抗病功能都是必需的。基于这两个关键SNP位点，研究者开发了一个显性分子标记Lr30MAS-47FR（补充数据1；补充图15），该标记能在54°C退火条件下特异扩增出携带Lr30基因的材料中的916 bp片段（补充图18）。在对包含158份普通小麦、82份四倍体小麦和69份一粒小麦的共309份种质资源进行检测后，该标记仅在已知的Lr30携带者PI 192051、RL6049和PI 619381中扩增出目标条带（补充表8），显示出良好的特异性和应用潜力。
Lr30蛋白的特性分析
qRT-PCR分析表明，在接种叶锈菌后1至4天，PI 192051中Lr30基因的表达水平显著上调（图7a），说明该基因的表达受到病原菌侵染的诱导。比较六倍体RL6049和四倍体PI 192051中Lr30的基础表达水平，未发现显著差异（补充图19）。系统发育分析显示，Lr30与已知的禾本科NLR蛋白关系较远，与水稻的Pib基因亲缘关系相对最近，但序列相似性低于38.7%（补充图20）。利用GFP融合蛋白技术，在本生烟草（N. benthamiana）叶片和小麦原生质体中观察到，Lr30蛋白同时定位于细胞质和细胞核（图7b, 7c；补充图21）。在烟草叶片中瞬时表达Lr30全长蛋白或其单独的结构域（CC, NB, LRR）均不会像阳性对照BAX那样诱导明显的细胞死亡或黄化（图7d）。利用AlphaFold2和AlphaFold-Multimer进行的蛋白质结构预测显示，Lr30的CC结构域以及包含两个NB和LRR的结构域（NB-NB-LRR）均可能形成五聚体（pentamer）的抗病小体（resistosome）结构（补充图22）。有趣的是，两个关键的功能性氨基酸位点中，R662（在抗病型中为C）位于预测的五聚体界面内部，而E533（在抗病型中为K）则位于预测的抗病小体外部表面（图7e）。
图7全文总结与展望
本研究成功地利用高质量基因组组装和EMS诱变群体相结合的策略，克服了在小麦着丝粒附近低重组区域克隆基因的困难，鉴定并克隆了来源于四倍体硬粒小麦PI 192051的叶锈病抗性基因Lr.ace-4A。研究确凿地证明了Lr.ace-4A与先前在六倍体普通小麦中发现的Lr30基因为同一个基因，从而澄清了长期以来关于这两个基因关系的疑惑。Lr30编码一个独特的、包含串联NB-ARC结构域的CC-NB-NB-LRR型免疫受体。
研究揭示了Lr30基因作用的一个重要特性：其在四倍体小麦中提供近乎免疫的强抗性，但在六倍体小麦背景下抗性效果则明显减弱。虽然过表达Lr30可以在六倍体中恢复强抗性，但这种现象提示六倍体基因组中可能存在抑制或修饰Lr30功能的因子，这与其它一些从低倍体转移到高倍体小麦后抗性减弱的基因（如Sr21, Pm8）情况类似。进一步鉴定这些可能的抑制因子将有助于理解小麦复杂的基因调控网络，并可能为改良Lr30在普通小麦中的应用效果提供途径。
尤为重要的是，研究通过单倍型分析和功能验证， 发现了两个区分抗病与感病Lr30单倍型的关键氨基酸多态性位点（E533K和R662C），证明这两个自然变异对于Lr30的抗病功能缺一不可。这一发现不仅加深了对NLR蛋白功能位点的理解（特别是对于这种非典型NLR），也暗示了Lr30的抗病功能骨架可能广泛存在于小麦种质资源中。随着基因编辑技术（尤其是碱基编辑）的飞速发展，未来或许可以通过精确编辑这两个关键位点，直接将感病型Lr30转化为抗病型，从而快速提升小麦品种的叶锈病抗性。
此外，本研究产生的PI 192051高质量参考基因组是硬粒小麦研究的重要资源。开发的Lr30特异性分子标记将极大地便利育种家在小麦育种项目中追踪和选择该基因。虽然Lr30在普通小麦中的天然抗性有限，但其克隆为通过基因工程手段（如多基因聚合、优化表达）来增强和利用该基因提供了可能。综合来看，这项研究为小麦叶锈病抗性遗传改良提供了宝贵的基因资源、分子工具和理论基础。未来的研究方向可包括：深入探究Lr30抗性在六倍体中减弱的分子机制，解析其识别叶锈菌效应子的过程，以及利用结构生物学方法进一步验证Lr30抗病小体的结构和功能。
研究团队与资助
该研究由Shisheng Chen（北京大学现代农业研究院/潍坊现代农业山东省实验室）设计并主导，Jinwei Yang、Hongna Li（北京大学现代农业研究院/潍坊现代农业山东省实验室）、Mengyu Li（河北农业大学）和Rui Song（北京大学现代农业研究院/潍坊现代农业山东省实验室）等完成了主要实验。Tao Shen和Shams ur Rehman参与了EMS突变体的筛选。Baoxing Song、Hongna Li和Dong Xu完成了基因组组装。Guiping Wang、Lei Hua和Yanyan Liang参与了载体构建。Ming Hao进行了细胞学分析。Aolin Jia和Lan Caixia参与了蛋白结构预测。Lan Caixia、Xingwang Deng和Jorge Dubcovsky提供了科研支持。Shisheng Chen、Jinwei Yang和Xiaodong Wang撰写了初稿。Shisheng Chen完成了最终稿件的撰写。Shisheng Chen、Xiaodong Wang和Baoxing Song为该研究的共同通讯作者和项目负责人。
研究工作得到了国家重点研发计划、山东省重点研发计划、山东省自然科学基金、国家自然科学基金、泰山学者计划、河北省自然科学基金、华北作物改良与调控国家重点实验室以及河北省科技计划等项目的资助。部分作者（S.C., J.Y., L.H., R.S., S.L.）已就Lr30基因在小麦育种中的应用申请了中国临时专利。
第一作者：Shisheng Chen (北京大学现代农业研究院/潍坊现代农业山东省实验室)
通讯作者：Shisheng Chen (shisheng.chen@pku-iaas.edu.cn; 北京大学现代农业研究院/潍坊现代农业山东省实验室), Baoxing Song (北京大学现代农业研究院), Xiaodong Wang (河北农业大学)。
DOI链接
https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-6289485/v1
小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn
投稿、合作等邮箱：shengweima@icloud.com
（转自：小麦研究联盟）
Hehson合作大平台期货开户 安全快捷有保障